Descripción del proyecto
CAD ES UN COMPLEJO MACROMOLECULAR QUE CONTROLA LOS PASOS INICIALES DE LA SINTESIS DE NOVO DE PIRIMIDINAS, ESTA IMPLICADO EN EL DESARROLLO DE TUMORES, Y ES UNA DIANA DE FARMACOS ANTICANCERIGENOS, CAD ESTA FORMADO POR UN POLIPEPTIDO MULTIFUNCIONAL DE 253 KDA QUE CONTIENE TRES FUNCIONES ENZIMATICAS, CARBAMIL FOSFATO SINTETASA II (CPSII), ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATC) Y DIHIDROOROTASA (DHO), CADA UNA CATALIZANDO UNA DE LAS TRES REACCIONES INICIALES DE LA RUTA, LA ESTIMULACION DE LA ACTIVIDAD DE CAD ES ABSOLUTAMENTE NECESARIA EN CELULAS PROLIFERATIVAS Y TUMORALES PARA PERMITIR LA SINTESIS RAPIDA DE PIRIMIDINAS REQUERIDA PARA LA REPLICACION, Y LA ACTIVIDAD DE CAD ES UN PARAMETRO DEL POTENCIAL TUMORAL, POR TANTO, CAD ES UNA DIANA PARA EL DISEÑO DE FARMACOS ANTI-TUMORALES COMO PALA, UN INHIBIDOR BI-SUSTRATO DE LA ACTIVIDAD ATC, LA ACTIVIDAD DE CAD SE REGULA ALOSTERICAMENTE, SIENDO RETRO-INHIBIDA POR UTP, EL PRODUCTO FINAL DE LA RUTA, Y ACTIVADA POR EL PRECURSOR DE NUCLEOTIDOS FOSFORRIBOSIL PIROFOSFATO (PRPP), CAD TAMBIEN SE REGULA POR LA FOSFORILACION DEPENDIENTE DE LAS CASCADAS DE SEÑALIZACION DE LA MAP QUINASA Y DE PKA, ESTA FORMA DE REGULACION ES MUY IMPORTANTE EN EL CONTEXTO DEL CICLO CELULAR Y EN CANCER DE MAMA, Y AL MISMO TIEMPO, MODULA LAS PROPIEDADES DEL CONTROL ALOSTERICO DE CAD, A PESAR DE TENER UN PAPEL CLAVE EN EL METABOLISMO CELULAR Y DE SU IMPLICACION EN CANCER, NO EXISTE INFORMACION ESTRUCTURAL DIRECTA SOBRE CAD NI SOBRE NINGUNO DE SUS DOMINIOS, A EXCEPCION DE QUE SE ASOCIA FORMANDO UN HOMO-HEXAMERO DE 1,5X106 DA QUE VIAJA ENTRE EL NUCLEO Y EL CITOPLASMA DEPENDIENDO DE LA SITUACION FUNCIONAL DE LA CELULA O DEL ESTADIO DEL CICLO CELULAR, SE HAN DETERMINADO ESTRUCTURAS DE CPS, ATC Y DHO DE HOMOLOGOS EN BACTERIAS Y ARQUEAS PERO NO EXISTE INFORMACION ESTRUCTURAL DE NINGUNO DE SUS EQUIVALENTES EUCARIOTICOS QUE PUDIERA APLICARSE A CAD,DADO SU GRAN TAMAÑO Y SU NATURALEZA MODULAR, NOS PROPONEMOS DETERMINAR LA ESTRUCTURA DE CAD MEDIANTE UNA APROXIMACION QUE COMBINA LA CRISTALOGRAFIA DE RAYOS X Y LA MICROSCOPIA ELECTRONICA (ME) DE PARTICULAS INDIVIDUALES, SOBRE-EXPRESAREMOS CAD EN SISTEMAS HETEROLOGOS, ASI COMO LOS DISTINTOS DOMINIOS DE CAD CLONADOS Y EXPRESADOS DE MANERA INDEPENDIENTE, LLEVAREMOS A CABO ESTUDIOS DE CRISTALIZACION DE RAYOS X CON CAD PURIFICADA Y CON CADA UNO DE SUS DOMINIOS POR SEPARADO O COMBINADOS EN POSIBLES COMPLEJOS, DADO EL GRAN TAMAÑO DE CAD, ESPERAMOS QUE RESULTE UNA PARTICULA ADECUADA PARA ME, POR LO TANTO, EN PARALELO, NOS PROPONEMOS LA CARACTERIZACION DE LA ARQUITECTURA DE CAD MEDIANTE ME DE PARTICULAS INDIVIDUALES, PRIMERO USANDO TINCION NEGATIVA Y TECNICAS DE PROMEDIADO 2D, Y MAS TARDE, USANDO MUESTRAS VITRIFICADAS Y CRIO-ME, ESTA DOBLE APROXIMACION PERMITIRA COMBINAR RESULTADOS DE CRISTALOGRAFIA DE RAYOS X Y ME, COMO EL AJUSTE DE LAS ESTRUCTURAS CRISTALINAS DE LOS DOMINIOS EN LOS MAPAS DE BAJA RESOLUCION OBTENIDOS POR ME DE LA PARTICULA COMPLETA, LA CARACTERIZACION ESTRUCTURAL DE CAD AYUDARA A CLARIFICAR SU REGULACION POR FOSFORILACION, QUE ES UN PROCESO DE ENORME IMPORTANCIA EN CANCER DE MAMA, ADEMAS, ESPERAMOS ENTENDER A NIVEL ESTRUCTURAL EL TRANSPORTE DE INTERMEDIARIOS ENTRE LOS DIFERENTES COMPONENTES DEL COMPLEJO, POR SUPUESTO, DEBEREMOS PODER DESVELAR LOS MECANISMOS CATALITICOS Y DE REGULACION ALOSTERICA DE CAD, ESTO NOS ACERCARA AL DISEÑO RACIONAL DE COMPUESTOS QUE INTERFIERAN CON LA ACTIVIDAD DEL COMPLEJO Y QUE PUDIERAN GUIAR EN EL DESARROLLO POTENCIAL DE FARMACOS ANTI-TUMORALES,