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BIO2011-25343

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EL CONTROL DEL NIVEL DEL SUPERENROLLAMIENTO EN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE COMO DIA...

EL CONTROL DEL NIVEL DEL SUPERENROLLAMIENTO EN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE COMO DIANA DE ANTIMICROBIANOS S. PNEUMONIAE ES UN IMPORTANTE PATOGENO HUMANO. EL SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA ES UN PARAMETRO CELULAR ESENCIAL, CONTROLADO POR LAS DNA TOPOISOMERASAS, E IMPLICADO EN REPLICACION Y TRANSCRIPCION. LAS FLUOROQUINOLONAS ACTUAN SOBRE L... ver más

01/01/2011

ISCIII

206K€

Presupuesto del proyecto: 206K€

Líder del proyecto

INSTITUTO DE SALUD CARLOS III (ISCIII) No se ha especificado una descripción o un objeto social para esta compañía.

TRL 4-5 | 23M€

Financiación concedida El organismo AGENCIA ESTATAL DE INVESTIGACIÓN notifico la concesión del proyecto el día 2011-01-01 No tenemos la información de la convocatoria

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ISCIII

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Líder del proyecto

INSTITUTO DE SALUD CARLOS III (ISCIII) No se ha especificado una descripción o un objeto social para esta compañía.

TRL 4-5 | 23M€

Presupuesto del proyecto 206K€

Descripción del proyecto S. PNEUMONIAE ES UN IMPORTANTE PATOGENO HUMANO. EL SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA ES UN PARAMETRO CELULAR ESENCIAL, CONTROLADO POR LAS DNA TOPOISOMERASAS, E IMPLICADO EN REPLICACION Y TRANSCRIPCION. LAS FLUOROQUINOLONAS ACTUAN SOBRE LA TOPOISOMERASA IV (TOPO IV) Y LA GIRASA, NUEVOS ALCALOIDES DESCRITOS POR NOSOTROS ACTUAN SOBRE LA TOPOISOMERASA I (TOPO I). EL CROMOSOMA DE NEUMOCOCO SE ORGANIZA EN DOMINIOS DE SUPERENROLLAMIENTO CON REGULACION TRANSCRIPCIONAL COMUN, INDICANDO QUE EL SUPERENROLLAMIENTO ES UN FACTOR GENERAL DE CONTROL DE LA TRANSCRIPCION, SUPERPUESTA A OTRA REGULACION MAS ESPECIFICA. PUESTO QUE LA TRANSCRIPCION GLOBAL DEPENDE DEL NIVEL DE SUPERENROLLAMIENTO, QUE VARIA EN BACTERIAS EN DIFERENTES CONDICIONES AMBIENTALES, DICHO NIVEL SERIA CRUCIAL PARA LA PATOGENICIDAD DE S. PNEUMONIAE. SE ESTUDIARA EL NIVEL DE SUPERENROLLAMIENTO EN DIFERENTES CONDICIONES MEDIANTE ELECTROFORESIS 2D DE ALTA RESOLUCION EN GELES DE AGAROSA Y PCR EN TIEMPO REAL (QRT-PCR) DE LOS GENES DE LAS TOPOISOMERASAS. SE CONSTRUIRA UN SISTEMA PARA TESTAR NIVELES DE SUPERENROLLAMIENTO POR FUSION DE LOS PROMOTORES DE LOS GENES DE LAS TOPOISOMERASAS Y EL OPERON LUX. ASIMISMO SE ESTUDIARA EL PAPEL DEL SUPERENROLLAMIENTO EN LA REGULACION DE LOS GENES CAPSULARES Y DE COMPETENCIA (OPERON COMED). EL CROMOSOMA DE S. PNEUMONIAE TIENE 15 AGRUPAMIENTOS TRANSCRIPCIONALES Y 6 REGIONES FLANQUEANTES. SE TESTARA ESTA ORGANIZACION EN VARIOS GENOMAS DE NEUMOCOCO Y DE OTRAS BACTERIAS RELACIONADAS. PARA VALIDAR ESTA ORGANIZACION, SE INSERTARA PTC-CAT, QUE CODIFICA LA ENZIMA CLORANFENICOL ACETIL TRANSFERASA (CAT) EN LOS DIFERENTES TIPOS DE REGIONES CROMOSOMICAS Y SE CUANTIFICARA SU EXPRESION (ACTIVIDAD CAT Y QRT-PCR) EN DIVERSOS NIVELES DE RELAJACION. ADEMAS, SE INSERTARA LA REGION FLANQUEANTE 2 EN VARIAS REGIONES CROMOSOMICAS EN POSICION ADYACENTE A PTC-CAT Y SE CUANTIFICARA ASIMISMO LA EXPRESION DE CAT EN DIFERENTES CONDICIONES. PARA COMPARAR UNA RESPUESTA TIPO SOS Y LA DE ESTIMULACION DE LA TRANSCRIPCION POR RELAJACION, SE ESTUDIARA LA TRANSCRIPCION GLOBAL EN PRESENCIA DE LEVOFLOXACINA A DOS CONCENTRACIONES: 1 LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (MIC) PARA INACTIVAR UNICAMENTE SU BLANCO PRIMARIO (TOPO IV) Y 100 MIC PARA INACTIVAR TANTO TOPO IV COMO GIRASA (BLANCO SECUNDARIO). ENTRE LOS GENES DE LAS TOPOISOMERASAS, MIENTRAS GYRB Y TOPA (TOPO I) ESTAN EN AGRUPAMIENTOS, GYRA Y PARE-PARC (TOPO IV) NO LO ESTAN, PUDIENDO SER REGULADOS POR FACTORES ESPECIFICOS. LA REGULACION DE PGYRA DEPENDE DE LA CURVATURA DEL PROMOTOR. SE PURIFICARAN TRES PROTEINAS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A PGYRA (TOPO I, CBF1, Y LA PROTEINA H01), Y SE REALIZARAN ENSAYOS DE UNION IN VITRO TANTO A PGYRA COMO A UN DERIVADO SIN CURVATURA. ASIMISMO, SE ANALIZARA LA REGULACION SOBRE PGYRA IN VIVO (ACTIVIDAD CAT Y QRT-PCR) EN UNA CEPA CON UNA FUSION CROMOSOMICA PGYRA-CAT TRANSFORMADA CON PLASMIDOS QUE LLEVEN CADA UNO DE LOS GENES DE TOPO I, CBF1 Y H01. LOS REGULADORES DE PPARE-PARC SE ESTUDIARAN DE FORMA SIMILAR.LOS ESTUDIOS ESTRUCTURALES DARAN INFORMACION SOBRE LAS INTERACCIONES DE TOPO I, TOPO IV, Y GIRASA CON EL DNA Y SUS INHIBIDORES. SE PURIFICARA TOPO I Y SE CRISTALIZARA EN PRESENCA Y AUSENCIA DE DICHOS ALCALOIDES. SE REALIZARA MUTAGENESIS DIRIGIDA EN TOPA CLONADO EN E. COLI, SE PURIFICARAN LAS ENZIMAS MUTANTES Y SE ANALIZARAN SUS ACTIVIDADES. LA GIRASA (GYRA2GYRB2) Y LA TOPO IV (PARC2PARE2) SE ANALIZARAN POR MICROSCOPIA ELECTRONICA, SE SOMETERAN A TINCION NEGATIVA Y A RECONSTRUCCION 3D. NTIBACTERIANOS\REGULACION DE LA TRANSCRIPCION\FLUOROQUINOLONAS\SUPERENROLLAMIENTO\DNA TOPOISOMERASAS

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