Descripción del proyecto
LA FORMACION DE OLIGOMEROS POR AUTO-ASOCIACION DE PROTEINAS ES ESENCIAL EN LA NATURALEZA. MAS DE LA MITAD DE LAS PROTEINAS CONOCIDAS FORMAN ESTE TIPO DE ESTRUCTURAS PARA ADQUIRIR SU FUNCION. SIN EMBARGO, NO SE CONOCE MUCHO SOBRE LAS RAZONES POR LAS QUE LA EVOLUCION HA SELECCIONADO ESTOS COMPLEJOS Y LAS REGLAS QUE LAS PROTEINAS USAN PARA SER CAPACES DE INTERACCIONAR CONSIGO MISMAS Y CREAR HOMOMEROS ESTABLES. EN ESTUDIOS PREVIOS, NUESTRO GRUPO HA CREADO UNA NUEVA VERSION DE UNA PEQUEÑA PROTEINA CLARAMENTE MONOMERICA Y BIEN CONOCIDA, EL INHIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA 2 DE SEMILLAS DE CEBADA, QUE OLIGOMERIZA FORMANDO HEXAMEROS Y DODECAMEROS TOROIDALES COMPACTOS CON UNA CONFIGURACION ENTRE SUBUNIDADES DEFINIDA. LA NUEVA VERSION FUE DISEÑADA POR UNA SELECCION DE MUTACIONES SIGUIENDO REGLAS CONOCIDAS, OBTENIDAS A PARTIR DE ESTUDIOS PREVIOS EN PROTEINAS "DOWNHILL", PARA REDUCIR LA COOPERATIVIDAD DEL PLEGAMIENTO Y ACELERAR EL DESPLEGAMIENTO DE PROTEINAS. ESTOS COMPLEJOS TOROIDALES HAN SIDO CONFIRMADOS POR MICROSCOPIA ELECTRONICA, MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA, ULTRACENTRIFUGACION ANALITICA, CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR Y CALORIMETRIA. ADEMAS, HEMOS ENCONTRADO UN CAMBIO CONFORMACIONAL EN EL MONOMERO, CONSISTENTE EN UNA APERTURA PARCIAL Y RECONFIGURACION INVOLUCRANDO A LOS EXTREMOS N Y C-TERMINAL, QUE PROMUEVE LA OLIGOMERIZACION. EL PRINCIPAL RETO DE ESTA PROPUESTA ES COMPLETAR EL ESTUDIO DE ESTOS HOMOMEROS Y CONTROLAR A VOLUNTAD EL PROCESO DE OLIGOMERIZACION. PRIMERO, HEMOS DISEÑADO UNA SERIE DE EXPERIMENTOS PARA CARACTERIZAR A NIVEL ATOMICO LA ESTRUCTURA DE LOS HOMOMEROS Y LA CONFORMACION ALTERNATIVA QUE LAS SUBUNIDADES ADOPTAN EN EL COMPLEJO, INCLUYENDO LA CREACION Y PURIFICACION DE DIFERENTES MUTANTES QUE SERAN ANALIZADOS CON TECNICAS ESPECTROCOPICAS, DE MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA, DE MICROSCOPIA ELECTRONICA, DE RMN Y CRISTALOGRAFICAS. MEDIANTE ESTOS ESTUDIOS TAMBIEN SE ACLARARA EL PAPEL DEL MECANISMO DE INTERCAMBIO DE DOMINIOS EN LA FORMACION DE LOS ANILLOS. EL SEGUNDO OBJETIVO ESTA CENTRADO EN LA MODULACION RACIONAL DE LA DEPENDENCIA DE LA OLIGOMERIZACION CON LA TEMPERATURA, LA CONCENTRACION DE PROTEINA Y CON LA FUERZA IONICA. HEMOS PROPUESTO UNA LISTA DE MUTACIONES PARA CAMBIAR LA TENDENCIA A FORMAR HOMOMEROS, CREANDO UNA "REGLA" DE MUTANTES CON DIFERENTES PROPENSIONES A OLIGOMERIZAR. ADEMAS, PROPONEMOS PRODUCIR VERSIONES DE CI2 PARA SELECCIONAR LA FORMACION DE UNO DE LOS DOS HOMOMEROS, HEXAMERO O DODECAMERO, DE MODO QUE ASI COMPLETAREMOS EL CONTROL A VOLUNTAD DEL PROCESO DE OLIGOMERIZACION. FINALMENTE, LA PROPUESTA INCLUYE DOS OPCIONES VIABLES PARA LA FUNCIONALIZACION DE LOS HOMOMEROS: LA INTERACCION DEL AGUJERO EN LOS COMPLEJOS TOROIDALES CON ACIDOS NUCLEICOS Y LA CREACION DE UN SITIO DE UNION A METALES. ESTA FUNCIONALIZACION ABRE LA POSIBILIDAD DE APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS FUTURAS PARA ESTE SISTEMA. ESPERAMOS SER CAPACES DE CARACTERIZAR CORRECTAMENTE EL PROCESO DE OLIGOMERIZACION PARA COMPRENDER MEJOR LOS PRINCIPALES PARAMETROS QUE CONTROLAN LA FORMACION DEL COMPLEJO. ADEMAS, ESTE PROYECTO VA A SER LA SEMILLA PARA FUTUROS PROYECTOS RELACIONADOS CON IMPORTANTES APLICACIONES EN EL AREA DE LA BIOTECNOLOGIA MEDIANTE EL DISEÑO DE NUEVOS SITIOS DE INTERACCION CON MOLECULAS DE INTERES. ISEÑO PROTÉICO\BIOTECNOLOGÍA\FUNCIONALIZACIÓN\INTERCAMBIO DE DOMINIOS\ANILLO TOROIDAL\OLIGOMERIZACIÓN