Descripción del proyecto
LA PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES DE INTERES INDUSTRIAL MEDIANTE EXPRESION HETEROLOGA ES YA UN METODO RUTINARIO PARA OBTENER EN GRANDES CANTIDADES PROTEINAS QUE SON DIFICILES O CARAS DE EXTRAER DE SU ORIGEN NATURAL, LAS LEVADURAS, PRINCIPALMENTE S, CEREVISIAE Y KOMAGATAELLA (PICHIA) PASTORIS, SE HAN CONSIDERADO UNA EXCELENTE OPCION PARA ELLO, YA QUE RETIENEN LA MAYORIA DE LAS VENTAJAS DE LA PRODUCCION MICROBIANA, PUEDEN SER MODIFICADAS GENETICAMENTE DE MANERA SENCILLA Y OFRECEN MUCHAS DE LAS CARACTERISTICAS DE EUCARIOTAS COMPLEJOS, SIN EMBARGO, LA EXPRESION EN LEVADURAS A ESCALA INDUSTRIAL TODAVIA PRESENTA ALGUNAS LIMITACIONES, EN PARTICULAR, SI BIEN LAS OPCIONES DE PROMOTORES TRANSCRIPCIONALES INDUCIBLES EN S, CEREVISIAE (GAL1, MET25, CUP1, ETC,) SON ADECUADAS A ESCALA DE LABORATORIO, NO LO SON PARA LA PRODUCCION INDUSTRIAL A GRAN ESCALA, YA QUE IMPLICAN MANIPULACIONES COMPLEJAS (P, EJ,, CAMBIOS EN LA FUENTE DE CARBONO), REQUIEREN CEPAS AUXOTROFICAS O EMPLEAN INDUCTORES TOXICOS, ANALOGAMENTE, EL SISTEMA MAS UTILIZADO EN P, PASTORIS, BASADO EN EL PROMOTOR AOX1, REQUIERE EL CULTIVO DE LA LEVADURA EN METANOL, UNA SUSTANCIA INFLAMABLE Y PELIGROSA, POR ELLO, SE ESTAN LLEVANDO A CABO EN LOS ULTIMOS AÑOS INTENSOS ESFUERZOS PARA ENCONTRAR PLATAFORMAS DE EXPRESION DE LEVADURAS BASADAS EN PROMOTORES INDUCIBLES ALTERNATIVOS MAS CONVENIENTES,EN ESTE PROYECTO PROPONEMOS EL DISEÑO Y CONSTRUCCION DE NUEVAS PLATAFORMAS DE EXPRESION DE PROTEINAS INDUCIBLES EN S, CEREVISIAE, DESDE UN ENFOQUE DE INGENIERIA DE PROMOTORES HIBRIDOS Y EMPLEANDO MODULOS SINTETICOS CAPACES DE SER REGULADOS POR ALCALINIZACION MODERADA DEL MEDIO, LA OPORTUNIDAD DE ESTA PROPUESTA SE BASA EN: I) LA IDENTIFICACION, EN BUENA MEDIDA POR NUESTRO LABORATORIO, DE UNA COLECCION DE ELEMENTOS QUE SON CAPACES DE INDUCIR O REPRIMIR LA EXPRESION GENICA EN RESPUESTA A UNA ALCALINIZACION LEVE (Y DE LAS VIAS DE SEÑALIZACION IMPLICADAS); II) EL DESARROLLO Y DISEÑO DE CAJAS DE HERRAMIENTAS DE COMPONENTES SINTETICOS, BASADOS EN LOS AVANCES REALIZADOS EN LOS ULTIMOS AÑOS EN LA COMPRENSION DE LOS MECANISMOS FUNDAMENTALES DE LA REGULACION TRANSCRIPCIONAL Y EN LOS NOVEDOSOS CONCEPTOS DE LA BIOLOGIA SINTETICA,POR ELLO, PROPONEMOS EL DISEÑO, CONSTRUCCION Y ENSAYO, A NIVEL DE LABORATORIO Y BIORREACTOR, DE UNA COLECCION DE PROMOTORES BASADOS EN DIVERSOS ELEMENTOS TRANSCRIPCIONALES BASALES COLOCADOS BAJO EL CONTROL DE COMPONENTES POSITIVOS (CDRE, STRE, PHO,,,) O NEGATIVOS (MIG1/2, NRG1, ,,) Y QUE SERAN UBICADOS EN PLASMIDOS O INTEGRADOS EN EL CROMOSOMA, LA EXPRESION EN ESTOS NUEVOS SISTEMAS PODRIA ACTIVARSE A VOLUNTAD MEDIANTE INDUCTORES MUY BARATOS (COMO KOH) Y EL NIVEL DE INDUCCION SERIA MONITORIZADO Y REFINADO EN LINEA CON DISPOSITIVOS SIMPLES, ADECUADOS A ESCALA INDUSTRIAL, TAMBIEN PROPONEMOS CONDICIONES AMBIENTALES O MUTACIONES ESPECIFICAS QUE AUMENTARAN LA ROBUSTEZ DE LA LEVADURA, PERMITIENDO SU CRECIMIENTO A ALTA DENSIDAD POR ENCIMA DE PH NEUTRO, FINALMENTE, QUEREMOS DILUCIDAR POR VEZ PRIMERA, MEDIANTE EL USO DE RNA-SEQ, LOS CAMBIOS TRANSCRIPCIONALES EN P, PASTORIS EN RESPUESTA A ALCALINIZACION MODERADA DEL MEDIO, EL TRABAJO PRELIMINAR HA DEMOSTRADO QUE LOS MODULOS REGULADORES RELEVANTES Y LAS VIAS DE SEÑALIZACION QUE SE HAN DEMOSTRADO EN S, CEREVISIAE ESTAN PRESENTES EN P, PASTORIS, LA IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE DICHOS MODULOS Y VIAS ESTABLECERA LA BASE PARA EL DISEÑO Y LA CONSTRUCCION DE UNA PLATAFORMA DE EXPRESION REGULABLE POR PH ALCALINO UTILIZANDO P, PASTORIS COMO HUESPED, EXPRESION HETEROLOGA DE PROTEINAS\BIOLOGIA SINTETICA\PROMOTORES REGULABLES\PROMOTORES HIBRIDOS\SEÑALIZACION POR PH ALCALINO\LEVADURAS